Investigação
Focado num método alternativo para destabilizar a pele e as membranas celulares: o uso de ondas de pressão para abrir transitoriamente canais através dessas barreiras, para que as moléculas possam difundir rapidamente antes de se fecharem reversivelmente (em poucos minutos). As ondas de pressão fotoacústicas aproximam-se do método ideal para a administração transdérmica de medicamentos, pois são indolores, não causam alergias ou contaminações e a pele recupera rapidamente após a administração do medicamento. Podem ainda ser o único método direto conhecido que permeia a membrana nuclear e oferece uma alternativa valiosa para a permeação controlada da membrana celular in vivo. Quando a onda fotoacústica gerada por um material apropriado atinge a barreira, produz um "terremoto" que perturba transitoriamente sua estrutura e aumenta sua permeação a grandes moléculas.A eficácia das ondas acústicas dependem da sua forma, ou seja, intensidade, tempo de subida, duração e pico de pressão. A entrega eficiente de uma molécula relativamente grande requer que uma pressão muito alta seja aplicada por um período de tempo muito curto no material biológico. O melhor método para gerar tal onda acústica é pela absorção de pulsos de laser muito curtos por um material apropriado. A energia radiativa aquece transitoriamente o material, provoca sua expansão térmica e, em um espaço confinado, origina eficientemente uma onda de pressão. Desenvolvemos materiais com base em novas geometrias e incluindo corantes ou carbono com morfologia adequada.
Moléculas e Materiais para Aplicações Sustentáveis
Um dos maiores desafios no campo da Química Biológica é o estudo dos mecanismos de dobramento de proteínas, ou seja, como uma cadeia polipeptídica não estruturada pode adotar rapidamente uma estrutura tridimensional única e densamente compactada. O dobramento errôneo é a base molecular para uma ampla gama de distúrbios humanos, como doenças neurodegenerativas, incluindo Alzheimer e Parkinson. Os primeiros eventos conformacionais relacionados com o dobramento, como a formação de segmentos helicoidais isolados, voltas reversas e ganchos β, ocorrem em microssegundos ou menos. O nosso objetivo é tornar os estágios iniciais de dobramento experimentalmente acessíveis, pelo que precisamos iniciar esses processos numa escala de tempo menor do que o evento estrutural de interesse. Usamos a técnica de salto de pH ultrarrápida para induzir o desdobramento de peptídeos e proteínas. As mudanças conformacionais durante o desdobramento são monitoradas por calorimetria fotoacústica resolvida no tempo (PAC), permitindo a determinação de constantes cinéticas, entalpia e mudanças de volume que acompanham o processo de desdobramento. O PAC é usado em complemento com outras técnicas de detecção rápida (espectroscopia de fluorescência e absorção transiente) e técnicas estruturais (RMN, CD, Absorção por Ultrassom). Atualmente focamos o nosso estudo em peptídeos modelo com estrutura secundária bem definida e proteínas suscetíveis ao desdobramento do pH.
Amilóides são definidos como uma classe de conjuntos supramoleculares de proteínas ou peptídeos mal dobrados em fibrilas de folha β, e sua deposição em tecidos e órgãos está associada a vários distúrbios médicos, incluindo doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Na busca por agentes moleculares que tenham impacto terapêutico sobre os agregados amiloides, várias classes diferentes de pequenas moléculas têm sido investigadas prevenindo ou retardando sua formação, mas este é ainda um objetivo não cumprido. Há uma grande necessidade para o desenvolvimento de métodos rápidos e confiáveis para triagem rápida in vitro de novos medicamentos que possam suprimir ou reverter a amiloidogênese. Foi recentemente desvendado que a agregação de proteína amiloidogênica induz uma nova banda de emissão na região do azul profundo (~450 nm) após excitação na faixa de comprimento de onda UV longo (~350 nm). É reconhecido que um aumento progressivo na emissão de fluorescência na região do visível é concomitante com o crescimento de agregados de proteína amilóide. Até agora, peptídeos e proteínas como α-sinucleína, β-amilóide(1-40),(1-42), tau, lisozima ou insulina mostraram exibir autofluorescência acompanhada de montagem de fibrilas amiloide. Queremos contribuir para a compreensão da natureza dos agregados formados durante a fibrilação amiloidal. Correlacionar a natureza das fibrilas amilóides com a fluorescência intrínseca observada em condições de fibrilação natural e presença de inibidores de agregação; investigar aceleradores de agregação (iões metálicos de Cu ou Zn); e desenvolver um método de triagem in vitro para inibidores de amiloide.baseado num leitor de microplacas de fluorescência
A albumina sérica humana (HSA) é uma biomacromolécula monomérica multidomínio considerada a proteína globular mais abundante no plasma humano com concentração normal na faixa de 30-50 g/L. De entre a importância biológica da HSA destaca-se a capacidade de transportar diferentes compostos endógenos e exógenos, como ácidos gordos, bilirrubina, vitaminas, fármacos, hormónas, esteroides e porfirinas, impactando no perfil farmacocinético de fármacos clinicamente aprovados e potenciais. A interação entre HSA e moléculas/drogas é examinada usando várias técnicas espectroscópicas, incluindo absorção UV-visível, dicroísmo circular, estado estacionário e fluorescência resolvida no tempo sob condições fisiológicas. Os dados calorimétricos da calorimetria de titulação isotérmica também são usados para determinar os parâmetros termodinâmicos das interações. Todos os resultados espectroscópicos, incluindo ensaios experimentais de deslocamento de drogas, são correlacionados com cálculos de docking molecular e simulações de dinâmica molecular para fornecer uma explicação a nível molecular da capacidade de ligação.
A base do efeito fotoacústico (PA) é a liberação não radiativa de parte da luz absorvida pelas moléculas num determinado material, resultando em aquecimento local e, portanto, na geração de uma onda de pressão (ou acústica) que se propaga para longe da fonte de calor. Desde a descoberta do efeito PA, em 1880 por A. G. Bell, as técnicas relacionadas à sua aplicação evoluíram para se tornarem métodos muito eficientes para caracterização térmica e óptica de materiais absorvedores de luz. A descrição abrangente do efeito PA em sólidos e líquidos, a invenção de fontes de laser intenso e o desenvolvimento de detectores acústicos altamente sensíveis contribuíram para esses avanços.
No nosso Laboratório, temos uma experiência acumulada de 30 anos na Calorimetria Fotoacústica (TR-PAC). Esta técnica foi inicialmente desenvolvida para estudos em solução, mas depois estendida para interfaces sólido:líquido. Novas configurações e metodologias foram desenvolvidas para esse fim, e se mostraram úteis para a caracterização de células fotoeletroquímicas.
A intensidade do sinal PA depende dos coeficientes de absorção da amostra no comprimento de onda da luz incidente, da eficiência de conversão da luz incidente em calor e de como o calor se difunde através da amostra. A informação espectroscópica pode ser obtida a partir da primeira dependência, e os espectros de absorção de sólidos opacos adquiridos. As informações sobre os canais de decaimento não radiativos são a base da TR-PAC, permitindo a determinação das variações entálpicas, cinéticas e de volume em processos fotoinduzidos. Ao longo dos anos, aplicamos essa técnica a reações de transferência de eletrão e protões, ao estudo fotofísico de estados tripletos, a reações de transferência de energia com formação de oxigênio singleto e muitas outras. Também usamos TR-PAC para acompanhar as mudanças conformacionais em peptídeos e proteínas. A reconstrução do calor desfundido por uma fonte irradiada é a base da técnica de imagem denominada Tomografia Fotoacústica. Esta técnica instalada nos nossos laboratórios tem grande potencial para aplicações em Biomedicina, pois combina as vantagens da detecção de resolução acústica com um agente de contraste de absorção de luz.